Serologinių sifilio ir laimo boreliozės reakcijų kryžminis reaktyvumas

Nagrinėjamos problemos aktualumas: sifilio ir Laimo ligos sukėlėjai Treponema pallidum ir Borrelia burgdoferi priklauso tai pačiai spirochetų šeimai. Šių infekcijų eiga žmogaus organizme yra lėtinė ir gali sukelti rimtus sveikatos pažeidimus. Abiejų ligų klinikinių simptomų spektras labai įvairus, o aktyvius ligos periodus gali keisti ilgai trunkantys besimptomiai arba labai mažai simptomiški ligos periodai. Serologinė abiejų šių infekcijų diagnostika yra labiausiai prieinama ir dažniausiai atliekama. Neretai klinikinę diagnozę bei gydymo paskyrimą lemia būtent serologinių laboratorinių tyrimų rezultatai.

Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad sergančiųjų viena iš dviejų (sifiliu arba Laimo borelioze) ligų kraujo serologiniai žymenys gali sąlygoti klaidingai teigiamus serologinių testų rezultatus ir dėl kitos infekcijos. Kiekvienoje laboratorijoje įdiegtų tyrimo metodų ir pasirinktų reagentų naudojimas gali turėti įtakos klaidingam teigiamų rezultatų dėl kryžminio reaktyvumo dažnumui. Šio fenomeno žinojimas ir įvertinimas atskiroje laboratorijoje gali skatinti egzistuojančių rutininių tyrimų parinkimo korekciją ir padėti išvengti diagnostinių klaidų, pagerinti laboratorijos teikiamų paslaugų kokybę.

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: nustatyti VULSK diagnostikos centre rutiniškai naudojamų serologinių sifilio ir Laimo boreliozės testų galimai klaidingų teigiamų rezultatų dažnumą dėl kryžminio viena iš šių infekcijų užsikrėtusiųjų pacientų kraujo serumų reaktyvumo.

Darbo uždaviniai:
1. Ištirti sifiliu sergančiųjų ir/ar teigiamais sifilio serologinių testų rezultatais įvertintų pacientų kraujo serumus Laimo boreliozės serologinių žymenų testais.
2. Ištirti Laimo berelioze sergančių ir/ar teigiamai Laimo ligos įvertintų pacientų kraujo serumus sifilio serologinių žymenų testais.
3. Nustatyti galimų klaidingai teigiamų serologinių tyrimų variantus/kombinacijas ir jų dažnumą.

Individualus darbo indėlis: šio darbo metu darbo autorė pati atliko kraujo serumo tyrimą dėl sifilio infekcijos (RPR, TPHA, imunofluorescentinis tyrimo metodas, imunofermentinis testas) ir dėl Laimo ligos (imunofluorescentinis tyrimo metodas); vykdė mokslinės literatūros paiešką ir ją analizavo; sistemino ir kritiškai vertino mokslinėje ir kitoje spaudoje paskelbtą informaciją nagrinėjamu klausimu; analizavo empirinius, praktinius ir eksperimentinius duomenis; interpretavo tyrimo rezultatus ir apibendrino pagrįstomis išvadomis ir pasiūlymais.

2. LITERATŪROS APŽVALGA 2.1. Trumpa sifilio kilmės ir plitimo istorija
Žmonijos bandymus įvertinti šios kadaise baisios ligos atsiradimą, plitimą, mėginimą apsisaugoti galima suskirstyti į 4 periodus:
1) iki 1910 m. buvo bandyta pritaikyti serologinė sifilio diagnostika,
2) 1910-1943 m. m. buvo pritaikita sifilio serologinė diagnostika,
3) efektyvus gydymas,
4) po 1982 m. – AIDS grėsmės eroje.

Sifilis iki 1910 metų. Daugelis mano, kad šią infekciją 1493 m. į Europą atvežė Kolumbo jūrininkai iš ką tik atrastos Amerikos. Jūrininkai užsikrėtė nuo vietinių gyventojų, o pastarieji, lytiškai santykiaudami su naminiais gyvūnais, užsikrėtė nuo lamų. Išsiskirstę šie jūrininkai išplatino infekciją po įvairius Ispanijos miestus. Iš čia liga plito į Prancūziją, Italiją ir kitas Europos šalis. Jau 1493 m. minėta „prancūzų liga“ (morbus gallicus) pasirodė jungtinėje Lietuvos ir Lenkijos valstybėje, o 1498 m. kalbama apie sifilio epidemiją Lietuvoje [25, 29].

Kai kurie mokslininkai mano, kad sifilis yra kilęs iš Afrikos ir kad endemiškų treponematozių (pinta, bedžel, frambezija) sukėlėjai esą atsiradę iš vienos treponemos. Ši pirminė treponema dėl skirtingų klimatinių ir buities sąlygų Afrikoje ir Europoje diferencijavosi į endemiškų treponematozių ir sifilio sukėlėjus [23].

Trečiosios teorijos šalininkai mano, kad sifilis nuo gilios senatvės buvęs ir Europoje, ir Azijoje, ir Afrikoje. Pasak jų, senovės mokslininkai ir gydytojai Hipokratas, Susruta, Galenas ir kiti mini opas, kondilomas, gumas, kurios gali būti sifilinės kilmės. Pastarąją teoriją remia ir kai kurie archeologiniai duomenys – būdingi sifiliui žmonių kaulų pakitimai, aptikti Europos kapavietėse, iki Amerikos atradimo [25].

1905 m. kovo 3 d. lietuvių kilmės protozoologas Fritz R. Schaudin (1871 – 1906) ir vokiečių dermatologas Erich Hoffman (1868- 1959) sėkmingai nudažė anilino dažais preparatus, kurie buvo paimti iš žmonių su pirminiu ir antriniu sifilio židiniais ir pademonstravo Berlyno Charite klinikoje. 1906 m. Karl Landsteiner (1868 – 1943) ir Victor Mucha parodė T. pallidum gyvas regėjimo lauke po mikroskopu. Atradus sukėlėją, netrukus pasirodė ir serologinė sifilio diagnostika [12].
Sifilis po 1910 metų. Po 1910 m. pritaikyta serologinė diagnostika leido nustatyti daugumą slaptos eigos sifilio formų, apie kurias anksčiau nebuvo žinoma. Literatūros šaltiniai rodo, kad sifilio simptomatika labai pasikeitė, lyginant su pirmaisiais sifilio epidemijos dešimtmečiais lapinskait [23].

AIDS grėsmės eroje. Vakarų šalyse sergamumas šiek tiek ėmė kilti 9 – jo dešimtmečio antroje pusėje, tačiau jį sulaikė masiškas AIDS pasirodymas ir ŽIV infekcijos lytinio perdavimo būdu įrodymas. Homoseksualistai pakeitė savo lytinę elgseną, dėl to mažėjo ir bendras sergamumas [4, 11, 40]. Tačiau sergamumo mažėjimas buvo trumpalaikis. Sumažėjus homoseksualistų epidemiologijai, nauja bėda tapo narkomanai. Dėl to staigiai ėmė daugėti ir įgimto sifilio atvejų. Dėl tokios kritiškos padėties Amerikos Ligų kontrolės centras rekomendavo ištirti visas nėščias moteris dėl sifilio, o gimdymo metu imti kraują ne iš virkštelės, o iš motinos, kad būtų išvengta klaidingų laboratorinių atsakymų [3, 7, 13].

ŽIV infekcija rodo, kad sifilio eiga vėl gali įgyti pirmykštį pobūdį, kaip ir XVI amžiuje. Pradėjo ryškėti centrinės nervų sistemos pažeidimai nebe trečiojoje, o antrojoje ligos stadijoje. Sergant AIDS tretinis neurosifilis išsivysto per 3 ligos mėnesius. Dėl to šiems pacientams nustatytos penicilino dozės tapo neadekvačios [22].

2.2. Sifilio epidemiologija
Sifilis paplitęs visame pasaulyje, tačiau jis ypač dažnas besivystančiose šalyse. Daugiausia serga sifiliu 20-39 m. amžiaus žmonės, bet gali sirgti įvairaus amžiaus.
Sifilio sergamumo rodikliai Lietuvoje: 1992 m. – 286 žmonės, 1993 m. – 694, 1994 m. -2182, 1995 m. – 3379, 1996 m. – 3761, 1997 m. – 3146, 1998 m. – 2326, 1999 m. – 1676, 2000 m. – 1171, 2001 m. – 881 žmogus [54].

2.3. Sifilio sukėlėjas
Treponema pallidum atrado ir aprašė
1905 m. Schaudin ir
Hoffman’o [45]. Tai spiralės pavidalo
mikroorganizmas. Vingio ilgis – apie 1 um. Ji
yra labai judri ir juda gana būdingai: trūkčioja
pirmyn ir atgal, švytuoja, susitraukinėja,
išsilenkia ir sukasi apie savo išilginę ašį.
Pagal taisyklingus vienodus vingius, plonumą ir sudėtingus taisyklingus judesius,
1. pav. Sifilio ligos sukėlėjas ją galima atskirti nuo kitų spirochetų, kurios
Treponema pallidum [52] yra storesnės, jų vingiai netaisyklingi, nevienodi, o
judesiai primityvūs [8, 25]. Ji gali būti aptinkama skystyje tiesiogiai mikroskopuojant natyvinį preparatą tamsiame regėjimo lauke, paimtame iš pirminio – antrinio sifilio metu matomų bėrimų, ypač šlapiuojančių (1 pav.). Blyškioji treponema gali persilenkti. Tiriant elektriniu mikroskopu nustatyta, kad blyškioji treponema padengta apvalkalu. T. pallidum dauginasi tik būdama aktyvioje būsenoje. Ji skyla pusiau sykį per 30 val. Ne organizme treponema greitai žūsta nuo karščio, išdžiūvimo, antiseptikų, muilo ir vandens, nors citruotame kraujyje prie – 4° C gali išsilaikyti gyvybinga iki 3 parų. Esant 55 – 60° temperatūrai, žūna per 15 min. Atsparesnė žemoms temperatūroms, lavono audiniuose išsilaiko gyva 2 – 3 paras. 37° temperatūra yra optimali blyškiosioms treponemoms daugintis. 5% natrio hidrokarbonate žūna iškart, taip pat akimirksniu žūna 50 – 56° etilo alkoholyje [2, 13, 21, 43, 47].
2.4. Sifilio infekcijos šaltiniai ir užsikrėtimo būdai
Blyškioji treponema į žmogaus organizmą patenka pro pažeistą odą ar gleivinę. Ypač sifilis užkrečiamas pirminio ir antrinio sifilio metu [15]. Sifilis pagal užsikrėtimo būdą skirstomas į:
®įgytą syphilis acguisita (užsikrečia vaikas arba suaugęs), ®įgimtą syphilis congenita (užkrečiamas vaisius gimdoje nuo sergančios nėščios motinos).
Dažniausiai sifiliu užsikrečiama lytinių santykių metu (apie 98-99%), kai serga vienas iš partnerių, nes tada užsikrėtusiojo lytinių organų srityje dažnai esti sifilio išbėrimų, kurių paviršiuje yra blyškiųjų treponemų. Treponemos pro neryškius įtrūkimus ir nedideles erozijas, atsiradusias lytinių santykių metu, patenka į sveiko žmogaus organizmą ir jį užkrečia.
Buitinis sifilio perdavimas (per buitinės apyvokos daiktus, cigaretes, lūpų pieštukus), kaip ir perpilant kraujo produktus, yra teoriškai įmanomas, bet praktiškai labai retas [49]. Didžiausia sukėlėjo perdavimo grėsmė yra pirminio, antrinio ir ankstyvojo slapto sifilio metu. Persirgus sifiliu, imunitetas nesusidaro. Retais atvejais imanomas ir kitoks nei lytinis sifilio perdavimas:
S bučiuojantis, jei ligoniui ant lūpų ir liežuvio yra sifilio išbėrimų; S sergančiai sifiliu žindyvei maitinant kūdikį, ypač kai jos krūtų speneliai yra sutrūkinėję;
S medicinos darbuotojams tiriant arba operuojant sifiliu sergantį ligonį (nežinant,
kad pacientas yra užkrėstas ir nesiimant apsaugos priemonių); S retai – perpilant infekuoto žmogaus kraują [25, 41].
2.5. Sifilio inkubacinis laikotarpis Sifilio inkubacinis laikotarpis, t. y. laikas nuo užsikrėtimo momento iki pirmųjų ligos simptomų atsiradimo, dažniausiai trunka 3 savaites (21 dieną). Tačiau kartais jis sutrumpėja iki 10, net 8 dienų, o taip pat gali ir pailgėti iki 2 – 3 ir daugiau mėnesių (100 dienų). Inkubacinis laikotarpis gali pailgėti, jei ligonis tuo metu dėl kokių nors priežasčių (pvz., anginos, gonorėjos, furunkulų) yra vartojęs nedideles medikamentų dozes, kurios sifilio neišgydė, bet pakeitė jo eigą ir pailgino inkubacinį laikotarpį. Tokiems medikamentams priskiriami antibiotikai, pvz. trichomanozei gydyti vartojamas flagilis, trichopolis, metronidazolis, galintys prailginti sifilio inkubacinį laikotarpį. Treponema žmogaus organizme plinta ir dauginasi limfos sistemoje.Viena iš priežasčių, kodėl būtent limfos sistemoje dauginasi ir plinta treponema, yra tai, kad limfoje yra mažai deguonies. Jau pirmomis dienomis po užsikrėtimo blyškioji treponema patenka ir į kraujo sistemą ir kraujo dėka išnešiojama į organus ir audinius [21, 42, 48].
2.6. Sifilio patologija
Įgyto sifilio atveju T. pallidum į organizmą patenka per gleivines, paprastai – genitalijų ar per odos smulkius pažeidimus. Vieni mikroorganizmai dauginasi patekimo vietoje, kiti – per keletą valandų išsisėja retikuloendotelinėje sistemoje ir tada pradeda daugintis. Įgimto sifilio atveju infekcija patenka tiesiai į vaisiaus kraują pro placentą. Transfuzinio sifilio atveju – tiesiai į kraują su infekuoto donoro krauju.
Sifilis yra smulkiųjų kraujagyslių liga. Pažeidimo vietoje išsiplečia kapiliarai, endotelis patinsta ir proliferuoja [32]. Kai jų spindis užsidaro, įvyksta nekrozė, kuri matoma kaip audinio vientisumo pažeidimas. Apie kapiliarus susirenka limfocitai, plazminės ląstelės net gigantinės ląstelės, o vėliau – fibroblastai ir formuojasi nauji kapiliarai. Visa tai vadinama induracijos klinika. Gilūs pažeidimai gydomi palieka randus. Pažeidimų gilumas ir ryškumas priklauso nuo imuniteto. Tretinio sifilio sukelti pažeidimai yra hipererginės kilmės, nes pačių treponemų būna mažai, o audinių destrukcija didelė: gumos, infiltratai, kurie gali išopėti. Vėlyvajam sifiliui labai būdingi ir degeneraciniai pakitimai, kurie vyrauja sergant neurosifiliu ir kardiovaskuliniu sifiliu
[28, 32, 43, 47].
2.7. Sifilio klasifikacija
Epidemiologiškai sifilis yra ne viena, bet dvi ligos. Viena iš jų yra ankstyvasis sifilis (pirmuosius 2-4 metus). Jis priskiriamas ūmiai infekcijai. Didžiausias užkrečiamumas yra pirmaisiais dvejais metais, ypač pirmaisiais, toliau stipriai mažėja ir į ketvirtųjų metų pabaigą pasiekia nulį. Kitas sifilis yra vėlyvasis (daugiau kaip 4 metų trukmės), kuris gali sukelti kitas sveikatos problemas, priklauso nuo infekcijos vystymosi ypatybių bei pažeisto organo pakitimų [9, 13, 25, 30].
A. Įgytas sifilis:
1. Ankstyvasis sifilis (iki 2 metų):
pirminis;
antrinis;
latentinis ankstyvas

2. Vėlyvasis sifilis (daugiau nei 2 metai):
latentinis vėlyvas;
tretinis sifilis (įskaitant gumozinius pažeidimus, kardiovaskulinį sifilį ir neurosifilį).
B. Įgimtas sifilis:
1. Ankstyvasis įgimtas sifilis (pasireiškia < 2 m. amžiaus): ankstyvas simptominis; ankstyvas latentinis. 2. Vėlyvasis įgimtas sifilis (pasireiškia > 2 m. amžiaus): vėlyvas simptominis, vėlyvas latentinis [23, 28].
2.8. Sifilio diagnostika
Sifilio diagnostika remiasi anamneze, epidemiologija, klinika ir laboratoriniais tyrimais.
Laboratoriniai tyrimai. Blyškiosios treponemos identifikavimas. Sukėlėjas gali būti randamas žiūrint mikroskopu tamsiame regėjimo lauke medžiagą, paimtą iš kietojo šankerio, pirminio ir antrinio sifilio odos bėrimų bei plokščiųjų kondiliomų, šlapiuojančių ir vegetuojančių papulių. Medžiaga iš kietojo šankerio gali būti tiriama ir tiesioginės imunofluorescencijos reakcija, naudojant monokloninius antikūnius. Pastaraisiais metais sifilio diagnostikai pradėta naudoti ir polimerazės grandininė reakcija.
2.8.1. Laboratorinė serologinė sifilio diagnostika
Netiesioginis, serologinis sifilio diagnozavimas REAGININIAI TESTAI
1. Komplemento sujungimo reakcija – KSR Vasermano reakcija – RW su kardiolipininiu antigenu
2. Pasyvios agliutinacijos testas:

• Mikroprecipitacijos reakcija Agliutinacija su kardiolipidiniu antigenu
• VDRL testas (Venereal Disease Research Laboratory)
o VDRL
Agliutinacija su kardiolipidiniu antigenu o VDRL Carbon o RPR (Rapid plasma Reagin)
Agliutinacija su kardiolipidiniu antigenu, absorbuotu ant anglies grūdelių TREPONEMINIAI TESTAI
1. Komplemento sujungimo reakcija – KSR Vasermano reakcija – RW su treponeminiu antigenu
2. Pasyvios agliutinacijos reakcija
TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination Assay) TPPA (Treponema Pallidum Particle Agglutination)
• Antigenas absorbuotas ant nešėjo (viščiuko arba avino eritrocitų, želatinos grūdelių)
• Testas atliekamas U formos 96 šulinėlių plokštelėse
• Rezultatai vertinami vizualiai
3. Imunofermentinis testas – IFA
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) EIA (Enzyme Immuno Assay)
• Testas atliekamas 96 šulinėlių plokštelėse, padengtose antigenu
• Rezultatai vertinami su spektrofotometru
4. Netiesioginis Imunofluorescencijos testas
FTA – ABS (Fluorescent Treponemal Antibody ABSorbtion)
• Objektinis stiklelis, padengtas antigenu
• Bandiniai tiriami fluorescenciniu mikroskopu
5. Treponemų imobilizacijos reakcija – TIR
TPI (Treponema Pallidum Immobilization testas) arba Nelsono testas [25, 47, 51].
2.9. Trumpa Laimo ligos istorija
Atskiri Laimo boreliozės sindromai Europoje buvo žinomi nuo 19- ojo amžiaus pabaigos, tačiau ligos sukėlėjas – Borrelia burgdorferi – atrastas tik 1982 metais (nuo tada pradėtas ir ligos etiotropinis gydymas) [47].
Tai yra infekcinė sisteminė Borrelia rūšies spirochetų sukelta liga, kurios sukėlėjus žmonėms perduoda erkės. Šios ligos atradimo istorija – tai medicinos progreso, įvairių simptomų bei sindromų sintezės pavyzdys. Jau 1863 m. A. Buchwald aprašė odos pakitimus, pavadinęs juos lėtiniu atrofiniu akrodermatitu. Vėliau 1910 – 1913 metais A. Afzelius ir B. Lipschūtz aprašė migruojančią eritemą ir tik 1921 m. Afzelius įtarė, kad tam tikrą vaidmenį šios ligos etiologijoje turi erkės. C. Garin ir D. Bujadoux 1922 m. aprašė neurologinę simptomatiką esant migruojančiai eritemai, o 1941 m. A. Bannwarth aprašė limfocitinio meningoradikulito atvejus.
Tik 1975 m. JAV A. Steere ir kiti aprašė vaikų artrito epidemiją Konektikuto valstijoje, Laimo miestelyje, įrodydami ryšį tarp sąnarių pakenkimo bei erkės įkandimo ir po jo atsiradusio odos paraudimo. Tai pavadino „Laimo artritu“, o vėliau šią ligą imta vadinti tiesiog „Laimo liga“. 1982 m. W. Burgdorfer, A. Barbour ir kiti įrodė, kad šios ligos priežastys yra spirochetos, kurias žmogui perduoda erkės. Taigi, praėjo 100 metų, kol buvo surastos šios mįslingos ligos priežastys ir visi pavieniai klinikiniai simptomai. Stebėjimai buvo apibendrinti ir sintezuoti į vieną nozologinį vienetą, pavadintą Laimo boreliozės vardu. Lietuvoje ši liga pirmą kartą buvo atrasta ir aprašyta 1987 m. vasarą Vilniaus universiteto Gamtinių židinių infekcijų mokslinio tyrimo laboratorijos ir Sveikatos apsaugos ministerijos surengtos mokslinės ekspedicijos metu [14, 15, 31].
2.10. Laimo ligos epidemiologija
Žmonių susirgimai Laimo liga yra registruojami daugelyje pasaulio šalių. Lietuvoje jie pradėti registruoti 1987 m. Lietuvoje Laimo ligos rodikliai kasmet didėja: 1991 metais – 60 žmonių, 1992 m. – 130 žmonių, 1993 m. – 676, 1994 m. – 656, 1995 – 941, 1996 m. – 785, 1997 m. – 1661, 1998 m. – 1498, 1999 m. – 766 žmonės, o 2000 m. sergamumo skaičius išaugo iki 1713, 2001 m. sumažėjo iki 1153, 2002 m. – iki 894, 2003 m. išaugo net 3688 žmonės. Laimo liga Lietuvoje turi aiškią sezoninę dinamiką: dažniausiai sergama liepos ir rugpjūčio mėnesiais [15, 54].

2.11. Laimo ligos sukėlėjas
Savo rūšies pavadinimą šie sukėlėjai
gavo prancūzų mikrobiologo A. Borrel, kuris
XX a. nagrinėjo spirochetų įvairovę, dėka [26].
Tai Gram (-), judrios, spiralės išvaizdos
spirochetos, turinčios nuo 7 iki 11 žiuželių
(judamųjų organėlių) (2 pav.) [15]. Šių
mikroorganizmų genetinė medžiaga
(dezoksiribonukleinė rūgštis, DNR) yra
2 pav. Laimo ligos sukėlėjas dvejopa: chromosominė ir ekstrachromosominė,
Borrelia burgdorferi [53] esanti plazmidėse. Genetinė borelijų sudėtis
(DNR) yra nevienoda. Pagal tai jos skirstomos į rūšis. Iš 11 esamų borelijų rūšių žmogui patogeniškos tik 3: B. burgdorferi, B garinii ir B. afzelii. Kadangi skirtingų rūšių borelijų DNR yra nevienoda, skiriasi ir jas sudarantys baltymai. Į borelijos sudėtį įeina apie 30 baltymų. Vieni baltymai yra nespecifiški borelijoms, panašūs į kitų spirochetų ar gramneigiamų mikroorganizmų baltymus (pvz., 60 kDa molekulinio svorio membranos baltymas). Kiti baltymai yra specifiški borelijoms ir vienodi visoms trims patogeninėms borelijų rūšims (pvz., 41 kDa molekulinio svorio žiuželinis antigenas). Rūšiai specifiški baltymai – t.y. skirtingi B. burgdorferi, B. garinii ir B. afzelii – yra išorinės membranos proteinai (Outer membrane proteins Omp: A, B, C, D, E, F). Šie baltymai turi keletą svarbių ypatybių: juos koduoja plazmidės, jų stiprios imunogeninės ir imunoapsauginės savybės, nuo jų priklauso borelijų organotropizmas, lemiantis ligos kliniką. Be to, OmpA ir OmpC baltymų sintezė priklauso nuo erkės fiziologinės būklės. Nepasimaitinusios erkės kūne esančios borelijos turi OmpA. Erkei pradėjus siurbti gyvūno ar žmogaus kraują ir dėl to pakilus temperatūrai erkės kūnelyje, borelijų OmpA baltymo sintezė nutrūksta ir pradedamas sintezuoti proteinas OmpC. Borelijoms migruojant iš erkės žarnyno į seilių liaukas ir perduodant jas gyvūnui ar žmogui, OmpC kiekis būna labai didelis. Šis baltymas yra labai imunogeniškas, tuo tarpu antikūniai prieš OmpA atsiranda labai vėlai po užsikrėtimo borelijomis ir labai nedideliais kiekiais. Šio fenomeno išaiškinimas tapo labai svarbiu žingsniu gaminant Laimo ligos vakciną. [14, 15, 19, 26].
2.12. Laimo ligos infekcijos šaltiniai ir užsikrėtimo būdai
Borelijų rezervuaras gamtoje yra smulkieji graužikai, elniai ir kiti laukiniai, rečiau naminiai žinduoliai, paukščiai, driežai. Iš vieno gyvūno kitam borelijas perneša Ixodes rūšies erkės. Žmogus užsikrečia įsisiurbus borelijomis užkrėstai erkei. Galimas, tačiau labai retas, transplacentinis borelijų perdavimas. Per karvių ir ožkų pieną Laimo ligos sukėlėjai neplinta. Nors borelijos kartais išskiriamos ir iš kitų kraujasiurbių vabzdžių, vienintelis infekcijos perdavėjas žmogui yra iksodinės erkės.
Per 2 gyvenimo metus erkės praeina 4 vystymosi stadijas: kiaušinėlis, lerva, nimfa ir suaugusi erkė. Kiekviena judri erkės forma maitinasi tik kartą per metus: lerva ir nimfa -pavasarį/vasarą, suaugusi erkė – vėlyvą rudenį. Visose vystymosi stadijose (išskyrus kiaušinėlio) erkė gali užkrėsti žmogų. Kai erkė įsisiurbia, borelijos migruoja iš žarnyno į seilių liaukas ir su seilėmis patenka į gyvūną. Užsikrečiama dažniausia praėjus 48 – 72 val. po erkės įsisiurbimo, nors yra aprašyta atvejų, kai borelijos pateko po keleto valandų. Tiesioginių duomenų apie borelijų perdavimą kraujo ar jo produktų perpylimo metu nėra, tačiau žinoma, kad borelija gali išgyventi kraujo produktuose [6, 15].
2.13. Laimo ligos inkubacinis laikotarpis
Laimo ligos inkubacinis laikotarpis nuo 2 iki 30 dienų, t. y. vidutiniškai beveik 2 savaitės. Pradiniai ligos požymiai būna panašūs į infekcinį procesą ir dažnai su odos pažeidimais. Dažniausiai susirgimo pradžioje atsiranda migruojanti eritema aplink pirminio afekto – tai vieta, kur buvo prisisiurbusi erkė [26]. Kaip jau buvo minėta, susirgimas gali prasidėti migruojančia eritema arba bendrais Laimo ligai būdingais simptomais: galvos skausmas, negalavimas, migruojančiais skausmais kauluose bei raumenyse, pykinimas, bendras silpnumas, negalavimas, karštligė. Karštinės periodas gali trukti keletą dienų (apie 15 dienų).
Erkės įgėlimo vietoje inkubacinio periodo pabaigoje pasireiškia nedidelis niežulys, kartais skaudantis ir matosi paraudimas. Dėmė pamažu didėja ir negydant jos skersmuo gali siekti nuo kelių iki 90 cm [5, 15, 26].
Dėmė (pritemai) būna ovalios, apvalios, rečiau trianguliarinės formos. Centras dažniausiai pašviesėjęs, kraštas ryškesnis, raudonos alyvinės spalvos „Jaučio akis“. Retkarčiais raudonės centre gali atsirasti mazgelis, pūslelės, pukšlė, išopėjimas ar šašas. Kraštas palaipsniui plečiasi ir po 4-8 savaičių paraudimas spontaniškai gali išnykti ir be gydymo. Dažniausiai lokalizuojasi pakinklyje, ant šlaunų, blauzdų, pilvo, rankų odos, nes borelijos iš pirminės patekimo vietos keliauja į kitas vietas. Borelijos plinta organizme hematogeniniu ar limfogeniniu būdu. Antrinės eritemos skiriasi nuo pirminių tuo, kad jos yra mažesnės. Ankstyvose Laimo ligos stadijose gali atsirasti retas odos pažeidimas – limfocitoma taip pat gali padidėti kepenys.
Laimo liga gali plėstis ir nesant odos pažeidimų, esant bendriems intoksikacijos požymiams ir karščiavimui.
Po 2 – 10 savaičių nuo ligos pradžios klinika charakterizuojama migruojančios eritemos išnykimu ir patologinių požymių pasireiškimu. Pažeidimai pasireiškia vidaus organuose: nervų sistemoje, širdyje, akyse ir kitur.
Dažnai nervų sistemos pažeidimai pasireiškia meningitu, radikuloneuritu, galvos nervų neuritu. Artritas išryškėja per keletą savaičių nuo ligos pradžios arba po migruojančios eritemos. Sąnarių pažeidimai neretai gali būti beeriteminės formos Laimo ligos sindromas. Pirmas besivystančio artrito požymis yra skausmas sąnariuose, sunku judėti [19, 26].
2.14. Laimo ligos patologija
Borelijos yra labai judrūs invaziniai mikroorganizmai, galintys penetruoti į įvairių organų audinių endotelio ląsteles ir kolonizuotis ekstraląsteliniuose tarpuose. Patekusios į žmogaus organizmą, borelijos pradeda daugintis odoje ir sukelia jos uždegimą. Kartais iš odos borelijos patenka į kraują ir diseminuoja po visus organus ir sistemas. Nors borelijos dažniausiai veikia kaip ekstraląstelinis sukėlėjas, jos gali įsiskverbti į jungiamojo audinio ląsteles, pvz., fibroblastus, tuo pačiu gali išvengti šeimininko imuninės sistemos poveikio bei imuninio atsako. Nors kraujo keliu borelijos diseminuoja po visą organizmą, pažeidimas išsivysto tik tam tikruose organuose, kuriems borelijos turi didžiausią tropizmą ir kurie yra vienaip ar kitaip izoliuoti nuo žmogaus organizmo imuninės sistemos (sąnariuose, širdies laidžiojoje sistemoje, nervų sistemoje, labai retai akyse). Nežiūrint ankstyvos diseminacijos, infekuotų organų pažeidimas atsiranda tik po kurio laiko – kelių savaičių, mėnesių, o kartais net metų. Apie 20% atvejų borelijos iš odos patenka tiesiai į kraują arba išplinta nervų skaidulomis, nesukeldamos odos uždegimo pirminio patekimo vietoje. Laikas tarp borelijų dalijimosi yra ilgas, o žmogaus organizmo uždegiminis ir imuninis atsakas į borelijas vystosi lėtai. Ankstyva lokalizuota ir ankstyva diseminuota boreliozės stadijos yra sąlygotos tiesioginio borelijų poveikio, t.y. mikroorganizmai dauginasi, dėl to kyla uždegimas ir organų pažeidimas. Šių stadijų prognozė yra palanki – 90% atvejų per pusę metų organizmo imuninė sistema eliminuoja infekciją be gydymo. Deja, kartais recidyvai, besikeisdami su remisijomis, arba ligos progresavimas nebylioje formoje baigiasi negrįžtamais organų pakitimais. Manoma, kad negydomos boreliozės perėjimas į lėtinę stadiją yra predisponuotas genetiškai. Šios stadijos patogenezė nėra visiškai neaiški (infekcinė ir/ar autoimuninė) ir prognozė nepalanki [15, 26].
2.15. Klinikinė Laimo ligos klasifikacija
Laimo Boreliozė yra sisteminė liga, pažeidžianti odą, centrinę – periferinę nervų sistemą, atramos judėjimo aparatą, širdį, akis [26].
Kiekvienam ligoniui patologiniai simptomai pasireiškia individualiai. Tai nulemia įvairios priežastys: amžius, premorbidinis fonas, gretutinės alerginės ir sisteminės ligos, širdies kraujagyslių ir nervų sistemos būklė [5].
Laimo liga, panašiai kaip sifilis, skirstoma į tris ligos stadijas. Pagal laiką ir klinikinius siptomus sunku tiksliai pabrėžti ligos stadiją.
Ankstyvoji Laimo liga (ūmi eiga):
I stadija – lokalaus pažeidimo stadija
II stadija – sukėlėjo diseminacijos stadija Vėlyvoji Laimo liga (lėtinė eiga):
III stadija – organų morfologinių pažeidimų stadija
Laimo ligos pirmojoje stadijoje 60 – 80% ligonių ant odos atsiranda ECM (lėtinė migruojanti raudonė). Tai patognominis (neabejotinas) Laimo ligos simptomas. Diagnozavus šį pažeidimą, nebūtinas serologinis tyrimas ir privaloma skirti antibiotikų kursą [15].
2.16. Laimo ligos diagnostika
Laimo ligos laboratorinei diagnostikai taikomi imunologiniai tyrimai (imunofluorescencijos reakcija, įvairių modifikacijų imunofermentiniai tyrimai, imunoblotingas, antigeno nustatymas šlapime, T – limfocitų prolifiracijos tyrimai ir kt.), molekulinės biologijos metodai – polimerazės grandininės grandininė reakcija (PGR), borelijų kultūros auginimas ir kt.
1. Humoraliniai testai:
IFR (netiesioginės imunofluorescencijos reakcija) ELISA (imunofermentinis tyrimas) Western blot (imunoblotingas)
2. Sukėlėjo tyrimas:
Kultūrų tyrimas (BSK – Mdium) Histologiniai tyrimai (Warthin – Starry) Elektroninė mikroskopija
3. Imunohistochemija:
Tyrimai monokloninių monospecifinių antikūnų pagalba (APAAP) 4. Ląsteliniai testai:
Specifinių ląstelių imuninės reakcijos ( T – limfocitų proliferacija, granuliocitų -makrofagų kolonijos stimuliuojančio faktoriaus sekrecija in vitro)
4. Polimerazinė grandininė reakcija (PGR) [15, 51].

3. EKSPERIMENTINĖ DALIS 3.1. Tyrimo medžiaga
Tyrimai atlikti Vilniaus universiteto ligoninės Santariškių klinikos (VULSK) Laboratorinės diagnostikos centro Mikrobiologijos laboratorijos Infekcijų žymenų tyrimų padalinyje.
Tyrimo medžiagą sudarė 40 serumų.
Serumai buvo surinkti ir ištirti nuo 2005 m. vasario iki 2006m. kovo mėn. Serumai įtraukti į tyrimą pagal kriterijus.
Įtraukimo į tyrimą kriterijai:
1. Teigiami serumai dėl sifilio buvo atrenkami atlikus nors vieną reakciją dėl sifilio, t.y. RPR, TPHA, Treponema pallidum IFA ar IFR. Į tyrimą buvo įtraukiami gavus teigiamą rezultatą (23 serumai dėl sifilio tyrimų buvo gauti iš VULSK Dermatovenerologijos centro) (1 lentelė).
2. Teigiami serumai dėl Laimo ligos buvo atrinkti gavus teigiamą rezultatą tiriant imunofluorescencijos metodu dėl Laimo ligos (8 serumai dėl Laimo ligos tyrimų buvo gauti iš VULSK Dermatovenerologijos centro) (1 lentelė).
3. Teigiami serumai dėl Laimo ligos taip pat buvo atrinkti atliekant reakciją su DRG
(JAV) Borrelia 14 kD ir OspC IgM ELISA. Šios reakcijos teigiamas rezultatas –
> 1.1.
Į Vilniaus universiteto ligoninės Santariškių klinikos laboratorinės diagnostikos centro Mikrobiologijos laboratorijos Infekcijų žymenų tyrimų padalinį iš UAB „Endemik“ buvo gauti serumai, kurių rezultatas buvo > 1.1 (UAB „Endemik“ atrinkti 24 serumai ištirti dėl Laimo ligos). Visi gauti iš UAB „Endemik“ 24 serumai buvo ištirti mūsų laboratorijoje su Borrelia burgdorferi IFR reakcija ir į tyrimą buvo įtraukiami tik tie serumai, kuriu titras > 1:256 taigi, iš 24 serumų į mūsų tyrimą buvo įtraukti 9 serumai.

3.2. Tyrimo metodai 3.2.1. RPR – greitoji plazmos reaginų reakcija (angl. Rapid Plasma Reagin) Paskirtis. RPR kokybinės ir kiekybinės reakcijos atliekamos ant kortelės, su 18 mm diametro tyrimo paviršiumi, skirtos serologiniam sifilio aptikimui netreponeminiais tyrimo metodais.
Tyrimo principas. RPR reagento sudėtyje yra antigenai, išskirti iš netreponeminių šaltinių (tai yra tiesiogiai nesusiję su treponeminiais mikroorganizmais), nustatantys reagino tipo imuninius baltymus serume. Šie į antikūnus panašūs baltymai išsiskiria į kraują, vykstant treponemos mikroorganizmų reakcijai su organizmo audiniais.
RPR antigeno suspensija – tai kardiolipidiniu antigenu padengtos anglies dalelės, reaguojančios su į antikūnus panašiomis medžiagomis – „reaginais“, kurių būna sifiliu sergančių asmenų serume ar plazmoje. Kai kuriais atvejais jų gali būti ir kitų ūminių, chroninių ligų atvėjais. Tiriamuose pavyzdžiuose reaginai jungiasi su testo antigenu, kurį sudaro kardiolipinu -lecitinu dengtos anglies dalelės, vyksta anglies dalelių ir reaginų flokuliacija bei koaguliacija, gerai matoma tamsių dribsnių šviesiame fone pavidalu. Reakcija yra makroskopinė ir todėl gerai optiškai matoma (3 pav.). Tiriamuosiuose pavyzdžiuose, kuriuose nėra reaginų, koaguliacija neįvyksta, tirpalas lieka homogeniškai šviesiai pilkos spalvos („Becton Dickinson and
Company“, JAV).
Reagentai. RPR plokštelinio antigeno suspensijos sudėtinės dalys: 0.003% kardiolipino, 0.020 – 0.022% lecitino, 0.09% cholesterolio, 0.0125 M EDTA, 0.01 M Na2HPO4, 0.01 M KH2PO4, 0.1% timerosalio (konservanto), 0.02% anglies (specialiai paruoštos), 10% cholino chlorido ir dejonizuotas arba distiliuotas vanduo.
Priemonės, reikalingos atliekant testą.
1. Į kasdieninį testavimą turi įeiti žinomo reaktyvumo titruoti kontroliniai serumai, kad galima būtų įsitikinti optimaliu antigeno reaktyvumu.
2. Rotatorius, 100 ± 2 apsukimų per min., kurio apsukos diametras – 2 cm su automatiniu taimeriu ir dangčiu.
Pavyzdžių paruošimas. Veninis kraujas imamas į mėgintuvėlius be antikoaguliantų. Serumas atskiriamas nuo kraujo krešulio kaip galima greičiau po kraujo sukrešėjimo.
Kokybinis testas. Atskirtą serumą automatine pipete 50ul užlašinam ant kortelės skritulio, atsargiai paskirstom po visą skritulio paviršių. Po to užlašinama RPR antigeno suspensijos ir kortelė sukama 8 minutes po dangčiu mechaniniu rotatoriumi.
Norint atskirti neigiamą nuo silpnai teigiamo rezultato, po rotacijos reikia trumpai pasukinėti ir pavartyti plokštelę rankoje (3 ar 4 kartus pirmyn atgal). Tyrimo rezultatai makroskopiškai vertinami tuojau pat ryškioje kaitrinės lempos ar dienos šviesoje.
Tyrimo rezultatas:
– „teigiamas“ – jei matomas charakteringas dribsnių iškritimas, kurio intensyvumas svyruoja nuo nedidelio bet aiškaus iki ryškaus ir intensyvaus. – „neigiamas“ – jei dribsnių iškritimo nėra. Silpnai – vidutiniškai teigiamas visada vertinamas kaip teigiamas.
Jei gavome teigiamą ar silpnai – vidutiniškai teigiamą rezultatą, toliau yra atliekamas kiekybinis testas:
Priklausomai nuo kokybinio rezultato intensyvumo, serumas toliau titruojamas. Jei yra stipri agliutinacija, tai titruojama maždaug 5 kortelės skrituliuose, o jei silpna – 3 skrituliuose. Ant kiekvieno skritulio sulašinama po 0.05 ml. 0.9 % Na Cl, po to tiek pat tiriamojo serumo užlašinama į pirmą skritulį, sumaišoma automatine pipete. Pernešama 0.05 ml. mišinio nuo pirmo skritulio ant antro, nuo 2 iki 3 ir t.t. Gale išpilamas likęs 0.05 ml. mišinio. Užlašinus RPR antigeno suspensijos į visus skritulius, daroma viskas taip pat kaip ir kokybiniame teste.
Vertinama pagal didžiausią praskiedimą, kuriame yra teigiamas rezultatas, taip pat, jei reakcija silpnai teigiama ar vidutiniškai teigiama

3.2.2. TPHA – Treponema pallidum hemoagliutinacijos reakcija (angl. Treponema Pallidum Haemagglutination Assay)
Paskirtis. Netiesioginės hemagliutinacijos reakcija skirta specifinių antikūnų prieš Treponema pallidum nustatymui žmogaus serume.
Principas. Paruošti viščiuko eritrocitai yra sensibilizuoti Treponema pallidum (Nikolso štamo) antigeno ekstraktu. Jei tiriamieji mėginiai yra teigiami, tai reakcijos pasekoje mikroplokštelės paviršiuje susidaro rausvos spalvos agliutinatai (4 pav.). Klaidingi teigiami reakcijų rezultatai gali būti gauti, sureagavus nepatogeninių štamų treponemų antikūnams („Omega diagnostics LTD“, United Kingdom).
Reagentai.
a) antigeninis reagentas: sensibilizuoti viščiuko eritrocitai;
b) kontrolinis reagentas: nesensibilizuoti viščiuko eritrocitai;
c) skiediklio tirpalas: fosfatinis buferis fiziologiniame tirpale su Reiterio štamo treponemų ir stabilizatoriaus tirpiais komponentais;
d) teigiama kontrolė: imunizuoto triušio serumas; praskiestas 1:20. Tikslus titras nurodytas ant buteliuko etiketės. Yra leistinas ± vieno praskiedimo nukrypimas;
e) neigiama kontrolė: normalus triušio serumas praskiestas 1:20.
Visi reagentai yra su 0.1% natrio azidu.
Reikalinga įranga.
– Apvaliadugnės mikrotitravimo plokštelės (U formos dugnu).
– Automatinės pipetės. Tyrimo eiga.
Atšildyti reagentus kambario temperatūroje (20 – 30 °C). Antigeninis ir kontrolinis reagentai turi būti kruopščiai resuspenduoti. Kokybinis testas.
Kiekvienam tyrimui reikia 3 plokštelės šulinėlių.
1. Įpilti 190 ul skiediklio į pirmą šulinėlį, į kitus du nereikia.
2. Įpilti 10 ul tiriamo serumo į pirmą šulinėlį.
3. Išmaišyti pirmo šulinėlio turinį ir iš jo perkelti 25ul į antrą šulinėlį. Sumaišyti vėl pirmame šulinėlyje likusį turinį ir perkelti į trečią šulinėlį 25ul.
4. Įpilti 75 ul kontrolinio reagento į antrą ir 75 ul antigeninio reagento į trečią šulinėlius.
5. Sumaišyti šulinėlių turinį, lengvai pasukant mikroplokštelę rankom arba apie 30 sek. rotatoriumi.
6. Inkubuoti uždengtą mikroplokštelę vieną valandą kambario temperatūroje. Saugoti ją nuo vibraciją ir karštį skleidžiančių šaltinių.

5. IŠVADOS
1. Nustatyta, kad dėl Laimo ligos atrinkti serumai gali reaguoti kryžmiškai su Treponema pallidum IFR reakcija.
2. Nustatyta, kad dėl sifilio atrinkti serumai dažnai reaguoja kryžmiškai su Borrelia burgdorferi IFR reakcija.
3. Kryžminis serologinis reaktyvumas sergant sifiliu stebimas dažniau nei sergant Laimo
liga.

Darbo autorius: T. SUBOČIŪTĖ

Atsiųsti pilną darbą sifilio-ir-laimo